Продукти

Новий високоефективний рідинний хроматографічний аналіз для глікозилтрансфераз, заснований на дериватизації антраніловою кислотою та флуоресцентному виявленні.

Аналіз було розроблено з використанням унікальної хімії мічення 2-амінобензойної кислоти (2AA; антранілової кислоти, AA) для вимірювання активності як β1-4 галактозилтрансферази (GalT-1), так і α2-6 сіалілтрансферази (ST-6) за допомогою високоефективної рідини хроматографія (HPLC) з виявленням флуоресценції (Anumula KR. 2006. Досягнення методів дериватізації флуоресценції для високоефективного рідинного хроматографічного аналізу вуглеводів глікопротеїну. Anal Biochem. 350:1-23).N-ацетилглюкозамін (GlcNAc) і N-ацетиллактозамін використовувалися як акцептори, а уридиндифосфат (UDP)-галактоза і цитидинмонофосфат (CMP)-N-ацетилнейрамінова кислота (NANA) як донори для GalT-1 і ST-6 відповідно.Ферментативні продукти мітили in situ AA і відокремлювали від субстратів на колонці TSKgel Amide 80, використовуючи умови нормальної фази.Ферментні одиниці визначали за площею піків шляхом порівняння з супутніми похідними стандартами Gal-β1-4GlcNAc і NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Були встановлені лінійність (час і концентрація ферменту), прецизійність (всередині та між аналізами) і відтворюваність аналізів.Виявилося, що аналізи корисні для моніторингу активності ферментів під час виділення та очищення.Аналізи були високочутливими та виконані так само або краще, ніж традиційні вимірювання на основі радіоактивного цукру.Формат аналізу також можна використовувати для вимірювання активності інших трансфераз за умови, що акцептори вуглеводів містять відновлювальний кінець для мічення.Було розроблено аналіз на акцептори глікопротеїну з використанням IgG.Для розділення гліканів IgG (біантеннарних G0, G1, G2, моно- та дисіалільованих) був розроблений короткий метод профілювання ВЕРХ, який полегшив швидке визначення активності GalT-1 і ST-6.Крім того, цей метод профілювання повинен виявитися корисним для моніторингу змін гліканів IgG у клінічних умовах.