Продукти

Розуміння метаболізму мікробного господаря має важливе значення для розробки та оптимізації біокаталітичних процесів на основі цілої клітини, оскільки це визначає ефективність виробництва.Це особливо вірно для окисно-відновного біокаталізу, де використовуються метаболічно активні клітини через ендогенну регенераційну здатність кофактора/косубстрату в хазяїні.Рекомбінантну Escherichia coli використовували для надмірного виробництва пролін-4-гідроксилази (P4H), діоксигенази, яка каталізує гідроксилювання вільного L-проліну в транс-4-гідрокси-L-пролін з a-кетоглутаратом (a-KG) як косубстратом.У цьому цільноклітинному біокаталізаторі центральний метаболізм вуглецю забезпечує необхідний косубстрат a-KG, поєднуючи біокаталітичну продуктивність P4H безпосередньо з метаболізмом вуглецю та метаболічною активністю.Застосовуючи інструменти експериментальної та обчислювальної біології, такі як метаболічна інженерія та аналіз (13)C-метаболічного потоку ((13)C-MFA), ми дослідили та кількісно описали фізіологічну, метаболічну та біоенергетичну реакцію цільноклітинного біокаталізатора. до цільової біоконверсії та виявив можливі метаболічні вузькі місця для подальшої раціональної розробки шляху. Штам E. coli з дефіцитом проліну був сконструйований шляхом видалення гена putA, що кодує проліндегідрогеназу.Біотрансформації цілої клітини за допомогою цього мутантного штаму призвели не лише до кількісного гідроксилювання проліну, але й до подвоєння швидкості утворення специфічного транс-4-L-гідроксипроліну (hyp) порівняно з диким типом.Аналіз потоку вуглецю через центральний метаболізм мутантного штаму показав, що підвищена потреба a-KG в активності P4H не посилює потік, що генерує a-KG, що вказує на суворо регульовану роботу циклу ТСА в досліджуваних умовах.У штамі дикого типу синтез і каталіз P4H спричинили зниження виходу біомаси.Цікаво, що штам ΔputA додатково компенсував пов’язану втрату АТФ і НАДН шляхом зменшення потреби в енергії для підтримки при порівняно низьких рівнях поглинання глюкози замість збільшення активності ТЦА. Виявлено, що нокаут putA в рекомбінантній E. coli BL21(DE3)(pLysS) бути перспективним для продуктивного каталізу P4H не тільки з точки зору виходу біотрансформації, але також щодо швидкості біотрансформації та поглинання проліну та виходу hyp на джерело енергії.Результати показують, що після нокауту putA зв’язок циклу TCA з гідроксилюванням проліну через косубстрат a-KG стає ключовим стримуючим фактором і мішенню для подальшого підвищення ефективності a-KG-залежних біотрансформацій.