Продукти

Мембранну топологію домену каналу коліцину E1 вивчали за допомогою флуоресцентного резонансного переносу енергії (FRET).FRET включав генетично закодовану флуоресцентну амінокислоту (кумарин) як донор і вибірково мічений залишок цистеїну, пов’язаний з DABMI (4-(диметиламіно)фенілазофеніл-4'-малеімід) як акцептор FRET.Флуоресцентний залишок кумарину був включений у білок через ортогональну пару тРНК/аміноацил-тРНК-синтетази, що дозволило селективне включення в будь-який сайт у межах домену коліцинового каналу.Кожен варіант містив стоп-мутацію (TAG) для включення кумарину та мутацію цистеїну (TGT) для приєднання DABMI.Шість міжспіральних відстаней всередині спіралей 1-6 були визначені за допомогою аналізу FRET як для розчинного, так і для зв’язаного з мембраною стану.Дані FRET показали великі зміни міжспіральних відстаней між спіралями 3-6 після асоціації з мембраною, що дає нове розуміння пов’язаної з мембраною структури домену каналу.Загалом, міжспіральна ефективність кумарину-DABMI FRET зменшувалася після зв’язування мембрани, спираючись на парасолькову модель для коліцинового каналу.Орієнтовна модель для закритого стану канальної області була розроблена на основі поточних і раніше опублікованих даних FRET.Модель передбачає кругове розташування спіралей 1-7 у напрямку за годинниковою стрілкою з позаклітинної сторони та мембранну міжфазну асоціацію спіралей 1, 6, 7 і 10 навколо центральної трансмембранної шпильки, утвореної спіралями 8 і 9.