Продукти

Спосіб, за допомогою якого ефекти одночасних мутацій комбінуються для зміни ферментативної активності, важко передбачити, оскільки ці ефекти не завжди є адитивними лінійним чином.Таким чином, характеристика ефектів одночасних мутацій амінокислотних залишків, які зв'язують субстрат, може зробити значний внесок у розуміння субстратної специфічності ферментів.У бета-глікозидазі Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) обидва залишки Q39 і E451 взаємодіють із субстратом, і це важливо для визначення субстратної специфічності.Подвійні мутанти Sfbetagly (A451E39, S451E39 і S451N39) були отримані шляхом сайт-спрямованого мутагенезу, експресовані в бактеріях і очищені за допомогою афінної хроматографії.Ці ферменти були охарактеризовані з використанням п-нітрофеніл бета-галактозиду та п-нітрофеніл бета-фукозиду як субстратів.Співвідношення k cat/Km для одиночних і подвійних мутантів Sfbetagly, що містять сайт-спрямовані мутації в положеннях Q39 і E451, було використано, щоб продемонструвати, що вплив на вільну енергію ESdouble Dagger (комплекс фермент-перехідний стан) подвійних мутацій (Gdouble daggerxy) не є сумою ефектів, що є наслідком окремих мутацій (Gdouble daggerx і Gdouble daggery).Ця різниця в Gdouble dagger вказує на те, що ефекти окремих мутацій частково накладаються.Отже, цей загальний ефект зараховується лише один раз у Gdouble daggerxy.Кристалографічні дані бета-глікозидаз виявляють наявність бідентатного водневого зв'язку із залученням залишків Q39 і E451 і такої ж гідроксильної групи субстрату.Отже, як термодинамічні, так і кристалографічні дані свідчать про те, що залишки Q39 і E451 справляють взаємний вплив на їх відповідні взаємодії з субстратом.